不同研磨方法對酵母菌DNA得率的影響

前段時間有實驗員說用酵母DNA試劑盒提取的酵母濃度很低，小新之前也提取過酵母DNA，記得濃度還可以，因此有點好奇。經過與實驗員溝通后小新懷疑是研磨方法不同導致的差異。小新之前提取酵母DNA用的是液氮研磨，而這次實驗員提取時由于液氮剛好用完了，采用的是直接研磨的方法。

酵母菌是一種真菌，具有細胞壁，想要提取酵母DNA首先就要將細胞壁破除。真菌的細胞壁和細菌不同，不能用溶菌酶破開，需要使用破壁酶，而這種酶在市場上比較少見，價格也較為昂貴，因此一般采取機械研磨的方法來破除真菌細胞壁，較為常見的機械研磨方法就是液氮研磨和研磨珠研磨。為了驗證研磨方法對DNA提取效率的影響，小新專門進行了以下測試，讓我們一起來看看吧。

一、實驗目的

測試不同研磨方法對酵母菌DNA得率的影響。

二、實驗材料

1．新鮮培養的酵母菌、研缽、液氮、1.5 ml離心管若干。

2．酵母DNA試劑盒（Simgen Cat.No.3401050）、RNase A（50 mg/ml）（Simgen Cat.No.8001001）、樣本裂解管L（Simgen Cat. No.: C-001-1）、樣本裂解管M（Simgen Cat. No.: C-001-2）和樣本裂解管S（Simgen Cat. No.: C-001-3）

3．臺式離心機（eppendorf centrifuge 5415 D）、水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）、旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）、超微量分光光度計（Simgen Cat.No.sim-100）、電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

三、實驗方法

1．收集過夜培養的酵母菌10 ml菌液，棄盡上清。

2．樣本的不同研磨方法：

直接研磨：

(1) 加入100 μl 70℃預熱的Buffer AT，勿棄吸頭，直接用吸頭吹打菌體沉淀，并將其吸出轉入研缽中，直接研磨約15分鐘左右充分破壞細胞壁。

(2) 向研缽中加入500 μl Buffer AT和2 μl RNase A，繼續研磨數次，用吸頭將裂解物轉入1.5 ml離心管，70℃水浴5分鐘。

(3) 加入20 μl蛋白酶K貯存液，旋渦振蕩30秒混勻，70℃水浴20分鐘。水浴期間每隔2~3分鐘翻轉離心管數次以幫助DNA的釋放。

液氮研磨：

(1) 加入100 μl 70℃預熱的Buffer AT，勿棄吸頭，直接用吸頭吹打菌體沉淀，并將其吸出轉入研缽中。倒入液氮浸沒菌液（菌液碰到液氮后會立即凝集成塊），用力研磨直至菌塊呈粉末狀。

(2) 當研成粉末狀的酵母開始融化時，向研缽中加入500 μl Buffer AT和2 μl RNase A，繼續研磨數次，用吸頭將裂解物轉入1.5 ml離心管，70℃水浴5分鐘。

(3) 加入20 μl蛋白酶K貯存液，旋渦振蕩30秒混勻，70℃水浴20分鐘。水浴期間每隔2~3分鐘翻轉離心管數次以幫助DNA的釋放。

樣品裂解管研磨：

（1）加入600 μl 70℃預熱的Buffer AT和2 μl RNase A，用吸頭吹打菌體沉淀，并將其吸出轉移到樣品裂解管中，旋渦振蕩15分鐘左右充分裂解酵母菌。70℃水浴5分鐘。

（2）加入20 μl蛋白酶K貯存液，旋渦振蕩30秒混勻，70℃水浴20分鐘。水浴期間每隔2~3分鐘翻轉離心管數次以幫助DNA的釋放。

（3）12000 rpm離心30秒，小心吸取上清至新的1.5 ml離心管中。

3．加入350 μl Buffer K，蓋上管蓋，用力搖晃15秒，旋渦振蕩30秒混勻。13000 rpm離心5分鐘。

4．將步驟3中的離心上清液倒入核酸純化柱（核酸純化柱置于2 ml離心管中）中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

5．棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6．棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7．棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，蓋上管蓋，13200 rpm離心2分鐘。

8．棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱中加入100 μl 70℃預熱的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置2分鐘，12000 rpm離心1分鐘得到酵母DNA。

四、實驗結果

1. 在超微量分光光度計上用Buffer TE調零，測量洗脫下來的DNA，結果如下：

表一 三種研磨方法數據對比

表二 不同型號的樣品裂解管研磨酵母菌的數據對比

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的酵母DNA進行電泳，結果如下：

                     圖一

M：1 kb plus DNA Ladder

1、2：直接研磨提取的酵母DNA

3、4：液氮研磨提取的酵母DNA

5、6：樣品裂解管M研磨提取的酵母DNA

圖二

M：1 kb plus DNA Ladder

1、2：樣品裂解管S研磨提取的酵母DNA

3、4：樣品裂解管M研磨提取的酵母DNA

5、6：樣品裂解管L研磨提取的酵母DNA

五、分析與討論

1. 由表一和圖一可知，三種研磨酵母菌的方法中，手動研磨方法效果最差，提取到的酵母DNA平均僅有1.6 μg，液氮研磨方法提取到的酵母DNA平均能達到5.1 μg，樣品裂解管的研磨效果最好，提取到的酵母DNA平均高達11.9 μg，是液氮研磨方法的2倍多，是手動研磨方法的7倍多。用玻璃珠震蕩法破碎酵母在很多文獻中都有記錄，在我們的實驗中也得到了很好的驗證。

2. 由表二和圖二可知，樣品裂解管M研磨酵母的效果是三種樣品裂解管中最好的。Simgen樣品裂解管目前有三種型號，L對應的是土壤樣本，M對應的是真菌樣本，S對應的是細菌樣本，而酵母屬于真菌，對應的是樣品裂解管M，這與實驗結果相一致。

3. 傳統液氮研磨方法在動植物樣本的研磨上效果明顯，但是在面對細菌、真菌樣本時效果就不明顯了，原因就是細菌、真菌類樣本是單個細胞分開的，研磨時看不出研磨效果，無法判斷是否研磨充分。而樣品裂解管可以根據樣本的大小選擇對應大小的研磨珠，達到最好的研磨效果，比液氮研磨效果更好，且不用費力研磨，只需拿著樣品裂解管旋渦振蕩就行，如果有條件，甚至可以購買相應的震蕩儀，直接解放雙手。